+7 (499) 322-30-47  Москва

+7 (812) 385-59-71  Санкт-Петербург

8 (800) 222-34-18  Остальные регионы

Бесплатная консультация с юристом!

Метод выделения ДНК: Ионообменные смолы

(Аникеев О. Е., Степущенко Ю. Г., Газетдинов Н. И., Кравцова О. А.) («Российский следователь», 2013, N 1)

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ОБЪЕКТОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ГЕНОТИПОСКОПИЧЕСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ

О. Е. АНИКЕЕВ, Ю. Г. СТЕПУЩЕНКО, Н. И. ГАЗЕТДИНОВ, О. А. КРАВЦОВА

——————————— Anikeev O. E., Stepushchenko J. G., Gazetdinov N. I., Kravtsovа O. A. The comparative characteristic of methods of allocation of DNA from various objects of a biological origin when carrying out examination on human biology.

Аникеев Олег Евгеньевич, Казанский (Приволжский) федеральный университет.

Степущенко Юлия Геннадьевна, Экспертно-криминалистический центр МВД РФ по Республике Татарстан, г. Казань.

Газетдинов Наиль Исламович, Казанский (Приволжский) федеральный университет.

Кравцова Ольга Александровна, Казанский (Приволжский) федеральный университет.

Авторы статьи проводят сравнительную характеристику различных методов выделения ДНК и анализируют результаты генотипоскопической экспертизы.

Ключевые слова: ДНК, судебно-биологическая экспертиза, реагент.

Authors of article carry out the comparative characteristic of various methods of allocation of DNA and analyze results of examination on human biology.

Key words: DNA, judicial and biological examination, reagent.

Введение. В последние годы при производстве судебно-биологических экспертиз активно применяется метод ДНК-анализа, основанный на изучении полиморфных локусов ДНК. Использование этого метода в экспертной практике быстро подтвердило его высокую эффективность в получении результатов, способствующих раскрытию и расследованию тяжких и особо тяжких преступлений, для идентификации биологических образцов индивидов. Несмотря на упрощение схемы анализа путем автоматизации процесса амплификации и регистрации получаемых результатов [4, 5], актуальной проблемой при проведении генетического анализа остается получение высококачественной ДНК-матрицы, особенно при исследовании образцов биологического происхождения, подвергшихся процессам деградации (гнилостные изменения, термические и химические воздействия) [1, 2, 6]. Согласно рекомендациям, предлагаемым экспертам-биологам Экспертно-криминалистическим центром МВД России, выделение ДНК в криминалистических лабораториях проводится ограниченным числом методов, таких как препарат хелатирующего реагента Chelex 100 (Promega, Ready Amp Genomic DNA Purification System, США) [9], коммерческий набор DNA IQ System (Promega, США) [11], выделение ДНК с использованием протеиназы К и последующей фенол/хлороформной очисткой, которые имеют ряд ограничений, или их использование не всегда является целесообразным, например, применение магнитных микрочастиц DNA IQ System при выделении ДНК из трупной крови [3, 7, 8]. В связи с этим, в данной работе проведен сравнительный анализ методов выделения ДНК из биологических объектов различной степени деградации с целью дальнейшей разработки рекомендаций по выделению ДНК, а также по организации работы с биологическим материалом в экспертных лабораториях ДНК-анализа. Материалы и методы. В работе проанализировано 10 объектов-носителей ДНК (табл. 1), наиболее часто встречающихся в экспертной практике. Все эксперименты по выделению ДНК проводились в 3-х повторностях.

Таблица 1. Характеристика объектов — носителей ДНК

Объект Предмет-носитель Размер

Кровь Марля (до 2-х недель) 0,5 x 0,5 см

Трупная Бумага (6 — 12 месяцев) 0,5 x 0,5 см кровь

Волосы Шапка (до 1-го месяца) 15 шт.

Слюна Буккальный соскоб (до 1-й недели) 0,5 x 0,5 см

Слюна Окурок сигареты (до 1-й недели) 0,5 x 0,5 см

Сперма Содержимое презерватива (12 — 24 0,5 x 0,5 см месяца)

Потожировые Рукоятка ножа (после обработки 3,0 x 3,0 см отпечатки дактопорошком) (до 1-го месяца)

Перхоть Шапка, следы перенесены на скотч (до 3,0 x 3,0 см 1-го месяца)

Мышечная 3 — 6 месяцев 5 г ткань

Костная 6 — 12 месяцев, гнилостные 5 г ткань изменения

Для выделения ДНК из объектов использовали коммерческие наборы Chelex-100 TM Resin (Bio-Rad, США) [9], DNA IQ System (Promega, США) [10], QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN Sciences, США) [11], PrepFiler Forensic DNA Extraction Kit (Applied Biosystems, США) [12] (выделение ДНК проводили согласно инструкциифирм-производителей), а также метод фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы K с некоторыми модификациями.

Оценку количества выделенной ДНК проводили методом ПЦР в реальном времени (Rt-PCR) с использованием коммерческого набора Quantifiler латинская буква «R» в окружности Human DNA Quantification Kit (Applied Biosystems, США) на приборе 7500 Real-Time PCR System (фирмы Applied Biosystems, США). Параллельно с этим использовался спектрофотометрический метод (СФ) определения качества и количества выделенных препаратов ДНК. Измерение проводилось на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., США), качество выделенной ДНК оценивали по отношению оптической плотности при длинах волн 260 и 280. Эффективность применения использованных методов выделения ДНК оценивали с помощью последующей амплификации аутосомных STR локусов с использованием мультиплексной системы GenePrint PowerPlex 16 System (Promega, США) [10]. Для этого вычисляли процент успешной амплификации, определяемый как соотношение количества локусов, для которых получен устойчивый, воспроизводимый профиль, к общему числу исследованных маркеров. Результаты и обсуждение. В ходе нашего исследования показано, что эффективность экстракции ДНК отличается в зависимости от того, какой объект биологического происхождения используется для выделения генетического материала: из 10 исследованных объектов — носителей ДНК только для половины образцов (кровь на марле (от живого лица), слюна (эпителиальный соскоб), сперма (содержимое презерватива), перхоть (перенесенная на липкую ленту), потожировые отпечатки) показана примерно одинаковая эффективность использованных наборов для выделения ДНК, при этом вне зависимости от выбранного метода экстракции нами получена 100% воспроизводимость результатов генотипирования. В то же время показано, что среди использованных наборов наибольшей эффективностью обладают методы выделения ДНК на основе наборов DNA IQ System (Promega, США) и PrepFiler Forensic DNA Extraction Kit (Applied Biosystems, США), которые являются наиболее оптимальными при работе со следами биологического происхождения, обнаруженных на различных предметах-носителях, в том числе и содержащих ингибиторы ПЦР. Основным преимуществом данных наборов является то, что они просты в использовании, при этом позволяют получить высокомолекулярный, чистый препарат ДНК (табл. 2).

Таблица 2. Концентрация препаратов ДНК, выделенных различными методами

Биологический Методы выделения ДНК объект ФХЭ Chelex 100 DNA IQ System QIAamp Prepfiler DNA Mini Kit

Концентрация ДНК (нг/мкл)

кровь на 0,185 0,217 2,245 12,167 12,930 марле

волосы 0,000 0,017 0,019 0,064 0,089

мышцы ингибирование ингибирование ингибирование 11,892 4,663

кость ингибирование не выделяли не выделяли 0,004 0,170

слюна с кл. 0,457 2,049 35,583 10,181 13,350 эпит. на ватной палочке

слюна с кл. 0,248 0,283 0,957 1,801 0,486 эпит. на окурке сигареты

сперма на 0,308 0,158 5,227 1,720 2,228 марле с сод. презерватива

пот с кл. ингибирование ингибирование 0,053 0,157 0,118 эпит. с рукоятки ножа

перхоть на 0,000 0,000 1,523 2,145 0,417 шапке, перенесенная на скотч

Однако при исследовании профиля аутосомных STR локусов, полученных с ДНК-матрицы объектов, подвергшихся процессам выраженной деградации или содержащих незначительное количество генетического материала, выбор метода экстракции ДНК оказался критическим (табл. 3).

Таблица 3. Эффективность амплификации ДНК из деградированных образцов (на базе системы «GenePrint PowerPlex 16 System»)

Образец Метод выделения % успешной амплификации

Кровь трупная на бумаге ФХЭ 100

DNA IQ System 81

QIAamp DNA Mini Kit 100

PrepFiler Forensic DNA 100 Extraction Kit

PrepFiler Forensic DNA 100 Extraction Kit

DNA IQ System 100

QIAamp DNA Mini Kit 100

PrepFiler Forensic DNA 100 Extraction Kit

DNA IQ System 68

QIAamp DNA Mini Kit 100

PrepFiler Forensic DNA 100 Extraction Kit

Волосы с шапки Chelex 100 0

DNA IQ System 100

QIAamp DNA Mini Kit 100

PrepFiler Forensic DNA 0 Extraction Kit

Учитывая полученные результаты амплификации по пяти исследуемым объектам, выделенными разными методами, можно утверждать, что из 15 аутосомных STR успешно амплифицировались все локусы, полученные на матрице ДНК, выделенной с помощью метода фенолхлорофомной экстракции (трупная кровь, мышечная и костная ткань, а также потожировые отпечатки) и с использованием набора PrepFiler Forensic DNA Extraction Kit (Applied Biosystems, США). Заключение. Для получения ДНК высокого качества наиболее предпочтительными методами выделения из мышечной и костной тканей, а также объектов, содержащих трупную кровь, являются фенолхлороформная экстракция и система PrepFiler Forensic DNA Extraction Kit (Applied Biosystems, США), для выделения ДНК из волос, потожировых отпечатков, в том числе и после обработки дактопорошком, рекомендуются системы Qiagen DNA Mini Kit (QIAGEN США) и DNA IQ System (Promega, США). Метод выделения ДНК с помощью ионообменной смолы Chelex-100 (Bio-Rad, США) позволяет получать хороший выход ДНК из незагрязненных биологических следов (эпителиальные клетки (например, слюна)).

Это интересно:  Таблица кбм по осаго

1. Иванов П. Л. Индивидуализация человека и идентификация личности: молекулярная биология в судебной экспертизе // Вестник Российской академии наук. 2003. Т. 73. N 12. С. 1085 — 1097. 2. Левченко Е. В. Следы человека биологического происхождения как объект криминалистического исследования: Дис. … канд. юрид. наук. 2007. С. 21 — 23. 3. Перепечина И. О. ДНК-анализ в криминалистических исследованиях органов внутренних дел России / НЦБ Интерпола в РФ: информационный сборник. 2003. N 19. С. 58 — 60. 4. Пименов М. Г. Особенности формирования базы данных о генетических признаках на основе автоматизированных информационных систем // Экспертная практика. 2006. N 40. С. 3 — 5. 5. Стороженко И. В. Исследование ДНК тканей и выделений человека на автоматизированных системах: Учебное пособие. М., 2011. С. 6 — 10. 6. Alaeddini R. Forensic implications of PCR inhibition // Forensic Sci. Int. Genet. 2011. V. 6. P. 297 — 305. 7. Maribel E. F. A comparison of the effects of PCR inhibition in quantitative PCR inhibition and forensic STR analysis // Electrophoresis. 2011. V. 32. P. 1084 — 1089. 8. Opel K. L. A study of PCR inhibition mechanisms using Real Time PCR // Forensic sciences. 2009. V. 55. P. 25 — 33. 9. Singer-Sam J. Use of Chelex to improve signal from small number of cells // Amplifications: a forum for PCR Users. 2004. N 3. P. 11. 10. Stepanov V. A. Characteristics of populations of the Russian Federation over the panel of fifteen loci Used for DNA identification and in forensic medical examination // Acta Naturae. 2011. N 3. P. 56 — 67. 11. Technical Bulletin Tissue and Hair Extraction Kit (for use with DNA IQ): protocol. Part 2. TB307 (Revised 5/06). Promega Corporation. Madison, WI, 2006.

TM 12. Testing the Effectiveness of the PrepFiler Kit for DNA Extraction from Forensic Samples (An Overview of Test Site Data). Applied Biosystems. Forensic News, 2008.

Исследование ДНК волос для идентификации личности

Преимущества использования методики выделения ДНК из волоса при помощи ионообменной смолы Chelex. Применение хлороформ-фенольной экстракции и последующих концентрирования и фильтрации экстракта на Центриконе-100″ для идентификации личности по волосам.

Рубрика Биология и естествознание
Предмет Судебно-биологическая экспертиза
Вид реферат
Язык русский
Дата добавления 23.09.2010

Подобные документы

Строение волоса: волосяная луковица и полотно волоса. Формирование и рост волос. Белок кератина как основная составляющая в составе волос. Патологическое выпадение волос (алопеция), ее виды. Андрогенетическая, диффузная, очаговая и рубцовая виды алопеции.

реферат [64,7 K], добавлен 11.05.2011

Исследование использования углерода и различных природных веществ микроскопическими грибами. Методы выделения и идентификации плесневых грибов, принципы составления питательных сред для них. Рост микромицетов на различных источниках углеродного питания.

дипломная работа [778,3 K], добавлен 11.09.2010

Характеристика и классификация микроорганизмов. Систематика, метаболизм и клиническое значение энтеробактерий. Сравнительный анализ традиционного и экспресс-метода биохимической идентификации при определении представителей семейства Enterobacteriaceae.

дипломная работа [8,9 M], добавлен 23.01.2018

Исследование анатомического строения надземных и подземных органов герани лесной — многолетнего травянистого растения. Ее применение в народной медицине. Установление основных анатомо-диагностических признаков цельного сырья с целью его идентификации.

статья [482,5 K], добавлен 26.07.2013

Организация лабораторной микробиологической службы. Принципы микробиологической диагностики инфекционных заболеваний. Методы выделения и идентификации бактерий, вирусов, грибковых инфекций, простейших.

реферат [3,8 M], добавлен 05.05.2006

Методы выделения чистых культур микроводорослей и способы их идентификации. Выделение чистой культуры Euglena glacilis; рассмотрение способов определения жизнеспособности клеток. Изучить влияния разобщителей дыхания и синтеза АТФ на подвижность клеток.

дипломная работа [1,7 M], добавлен 24.05.2012

Сущность генетической инженерии, методы идентификации трансгенных организмов; получение и технология ГМО, отличие от традиционной селекции, преимущества и недостатки. Состояние и перспективны развития рынка генетически модифицированных товаров в мире.

курсовая работа [1,1 M], добавлен 20.11.2010

Особенности использования антител иммунной системой для идентификации и нейтрализации чужеродных объектов. Анализ антигенсвязывающей и эффекторной функций антител. Обзор строения и структуры генов иммуноглобулинов. Процесс возникновения точечных мутаций.

реферат [829,2 K], добавлен 24.02.2013

Состав и направления деятельности кафедры микробиологии и иммунологии. Принципы работы в микробиологической лаборатории. Подготовка посуды и инструментов. Техника отбора проб, посева и приготовления питательных сред. Методы идентификации микроорганизмов.

отчет по практике [28,8 K], добавлен 19.10.2015

Флавоноиды как обширная группа полифенольных соединений, генетически связанных друг с другом. Знакомство с основными особенностями идентификации биологически активных веществ спектрофотометрическим методом в экстрактах листьев красной и чёрной смородины.

способ выделения днк

Изобретение относится к области нано-биотехнологии и может быть использован для выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее по тексту — ДНК) из различных биологических объектов.

Известен способ выделения ДНК с применением фенол-хлороформной смеси [1]. Недостатком способа [1] является высокая токсичность применяемых веществ, трудоемкость процедуры выделения, времязатратность (2-3 дня).

Известен способ выделения ДНК с использованием хелатирующего реагента — ионообменной смолы Челекс-100 (Chelex-100) [2]. Недостатком является низкое качество выделенного по способу [2] препарата ДНК из-за наличия посторонних примесей (продуктов лизиса клеток), невозможность выделения ДНК из костных и мышечных тканей, загрязнение препарата ДНК продуктами лизиса клеток (белки, липиды).

Наиболее близким по существу заявляемого способа, прототипом, является способ выделения ДНК с применением геномагнитных нанозахватчиков (GMNC), основанный на связывании молекул ДНК с ДНК-зондом сорбента [3].

Недостатком прототипа является ограниченность области применения способа [3] при необходимости выделения ДНК из широкого спектра различных биологических объектов (крови, слюны, волос), как это бывает, например, при проведении судебно-медицинской экспертизы. Низкое количество выделенной ДНК из костной и мышечной тканей, ногтевых пластин также ограничивает применение прототипа.

Целью предлагаемого изобретения является расширение перечня используемых для выделения ДНК биологических объектов, повышение производительности работы по выделению ДНК, повышение качества и количества выделенного образца ДНК, упрощение, сокращение продолжительности процедуры выделения, удешевление процесса.

Цели достигают тем, что получают наночастицы оксида железа Fe 3 O 4 . Наночастицы модифицируют путем присоединения к ним молекул хитозана. Готовят суспензию из наночастиц, проводят измельчение исследуемого биологического объекта, заливают его лизирующим буфером, инкубируют. Получают клеточный лизат. К лизату добавляют наночастицы, инкубируют, разделяют на фракции в виде осадка и надосадка, удаляют надосадок, к осадку добавляют элюирующий буферный раствор, перемешивают. Получают суспензию. Суспензию разделяют на фракции в виде осадка и надосадка, отбирают надосадок. Надосадок содержит выделенный препарат ДНК.

К клеточному лизату добавляют ранее приготовленный сорбент Fe 3 O 4 в 0,015 М ацетатном буферном растворе, например, в количестве 20 мкл взвеси модифицированных наночастиц на 1 мл клеточного лизата. Взвесь перемешивают (суспендируют), например, автоматической пипеткой. Затем перемешанную взвесь инкубируют в течение 30 мин, при температуре в диапазоне плюс 15-30°С. Пробирку с взвесью подвергают воздействию постоянного магнитного поля, например, путем помещения пробирки на стандартный лабораторный магнитный штатив. Под воздействием магнитного поля происходит разделение суспензии на две фазы: осадок — сорбент Fe 3 O 4 со связавшимися с ним молекулами ДНК и надосадок — лизирующий буферный раствор. Надосадок (супернатант) удаляют, а к осадку приливают отмывочный (элюирующий) буферный раствор, например, состава: 10 мМ трис-HCl, рН 7,4; 100 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА. Смесь перемешивают, например, автоматической пипеткой, затем пробирку помещают на стандартный лабораторный магнитный штатив, где под действием постоянного магнитного поля происходит разделение суспензии на две фазы: осадок — сорбент наночастиц Fe 3 O 4 и надосадок — элюирующий буферный раствор с молекулами ДНК. Надосадок отбирают в чистые емкости, например пробирки типа Эппендорф. Отобранный надосадок является конечным продуктом — раствором, содержащим выделенный препарат ДНК. Выделенный препарат ДНК в растворе применяют по назначению, например для постановки реакции амплификации.

Вышеописанным путем ДНК выделяют также из мышечных тканей, роговых тканей животных, ногтевых пластин, биологических объектов на предметах-носителях — марле, бумаге, синтетических тканях, крови различного состояния, спермы, волос, ногтевых пластин. Выделение ДНК из роговых тканей животных, ногтевых пластин проводится так же, как из костной ткани: перед процедурой выделения необходимо измельчить биологический объект. Однако для экстракции ДНК с предметов-носителей необходимо предварительно сделать смыв биологического материала. Для этого предмет-носитель (марля, бумага, синтетические ткани) размером 1×1 см помещают в 1 мл дистиллированной воды (dH 2 O) и инкубируют при температуре плюс 56-70°С, получают смыв биологического материала. Затем отделяют предмет-носитель и работают со смывом по описанному выше методу.

Заявляемый способ позволяет значительно быстрее, по сравнению с аналогами [1, 2], выделить ДНК — процедура выделения ДНК занимает не более 1,5 часов для самых сложных объектов. Выход продукта по заявляемому способу составляет до 200 нг (нанограмм) ДНК из 5 г костного порошка. У прототипа — не более. 150 нг из 5 г костного порошка. То есть заявляемый способ позволяет увеличить выход выделяемого препарата ДНК не менее чем в 1,5 раза. Заявляемый способ позволяет выделить ДНК из биологических материалов, например мышечной ткани, рогов, шерсти животных, ногтевых пластин, неприменимых для извлечения ДНК по способу-прототипу [3].

Спектрофотометрически опреденная степень очистки ДНК, например от примесей — белков и липидов по величине отношения длин волн А 260 /А 280 , составляет 1,8-2,0. Это соответствует общепринятому стандарту чистоты ДНК, то есть выделенный заявляемым способом препарат чист.

Заявляемый способ — безопасный, применяемые при выделении ДНК компоненты абсолютно безвредны для человека. Способ позволяет выполнять выделение ДНК из широкого спектра биологических объектов, недоступных для прототипа и аналогов, то есть обладает расширенной областью применения. Перечисленные результаты применения заявляемого способа подтверждают его новизну. Заявляемый способ выделения ДНК — осуществимый с применением стандартных технических устройств и оборудования в промышленном производстве продуктов питания, в деятельности организаций здравоохранения, полиции, животноводства. Это соответствует предъявляемому к изобретениям критерию «промышленная применимость»,

Предлагаемый способ выделения ДНК необходим специалистам различных областей, опирающимся в своей работе на данные молекулярно-генетического анализа, например диагностической медицине при определении заболеваний по образцу ДНК (гепатит, ВИЧ, наследственные заболевания), судебно-медицинской экспертизе, ветеринарии, сельском хозяйстве.

Приведенный пример применения предлагаемого изобретения показывает его полезность, например, для диагностики заболеваний людей в медицине и сельскохозяйственных животных — в ветеринарии. Применение предлагаемого способа выделения ДНК существенно расширяет перечень объектов, используемых для извлечения нуклеиновых кислот, например при производстве судебно-медицинской экспертизы.

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Заявляемый способ выделения ДНК имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.

Заявленное техническое решение можно реализовать в промышленном производстве аналитического и диагностического оборудования, в деятельности организаций пищевой промышленности, здравоохранения, животноводства, правоохранительных органов посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника ДНК используют костную ткань.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника ДНК используют роговые ткани.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника ДНК используют биологические объекты на предметах-носителях.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве источника ДНК используют биологические объекты на предмете-носителе — марле.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве источника ДНК используют биологические объекты на предмете-носителе — бумаге.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве источника ДНК используют биологические объекты на предмете-носителе — синтетической ткани.

Метод выделения ДНК: Ионообменные смолы

При применении методик идентификации хемолитотрофных организмов с использованием разновидностей полимеразной цепной реакции особенно остро встаёт вопрос о методах выделения и очистки бактериальной хромосомной ДНК. Ещё более важным он становится при использовании разновидностей ПЦР, в ходе которых проводится количественный анализ (ПЦР в реальном времени и т.д.). Наличие нелизированных клеток вносит в той или иной мере существенные погрешности в результаты количественного анализа и в ряде случаев может привести к недостоверным результатам.

Некоторые методы выделения ДНК могут вносить искажение в результат количественного анализа за счёт неэффективного лизиса клеток, сорбции ДНК на частичках грунта, наличия в препарате ферментативных и других ингибиторов, а также потери ДНК или нарушения ее структуры. Кроме того, качество препарата оказывает влияние на достоверность анализа, основанного на методах прямого определения нуклеотидной последовательности (секвенирования) и клонирования, широко применяемых при изучении структуры сообществ [1, 2].

Существует множество способов воздействия на клетки с целью их разрушения и последующей очистки содержащихся в них нуклеиновых кислот: химический, физический и ферментативный. К самым распространенным физическим способам относятся обработка ультразвуком, нагревание, механическое перетирание и разрушение клеточной стенки методом замораживания/оттаивания [3]. Химические способы разрушения клеток основаны на лизирующей активности некоторых солей и детергентов. И, наконец, к третьему распространенному способу воздействий относятся ферментативные подходы, использующие активность протеолитических ферментов (лизоцима и протеиназы К). Следует отметить, что наиболее распространенные методы выделения ДНК практически всегда представляют собой комплексный подход, включающий несколько этапов пробоподготовки.

В связи с этим целью работы стала апробация нескольких способов выделения ДНК и выбор метода, наиболее подходящего для анализа накопительных культур сообществ ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов. Получаемая смесь нуклеиновых кислот должна быть репрезентативной и, по возможности, сохранять количественное соотношение копий геномов каждого вида, входящего в состав пробы. Выполнение последнего условия необходимо для проведения точного количественного анализа сообществ.

Основной проблемой, которая должна была быть учтена при выборе методики выделения бактериальной ДНК, является неоднородность свойств данных микроорганизмов, среди которых особенно следует выделить свойства их клеточных стенок. Как известно, лизис грамположительных бактерий и архей (сходных по строению клеточной стенки с грамположительными эубактериями) осуществить гораздо сложнее по сравнению с лизисом грамотрицательных бактерий. А поскольку среди исследуемых микроорганизмов присутствуют представители всех вышеупомянутых групп, остро встаёт задача выбора универсальной методики выделения ДНК.

Для выделения ДНК (РНК) из клеток их необходимо предварительно лизировать. Пробоподготовка проводится также для удаления из полученного материала ингибиторов Taq-полимеразы (белковых примесей и др.) и различных РНКаз. Обработка проб проводится в микроцентрифужных пробирках типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл. Время обработки в зависимости от метода доходит до 3–4 ч.

На данный момент существует целый ряд методов для выделения ДНК из клеток. Анализ методик выделения ДНК наиболее целесообразно проводить среди методов, используемых с этой целью в практике клинического молекулярно-биологического анализа, поскольку большинство этих методов имеют относительно универсальный характер.

Следует отметить также достаточно низкий уровень освещённости подобных методов в русскоязычной литературе. По-видимому, это связано с тем, что большинство лабораторий используют для выделения и очистки ДНК заводские наборы, при работе с которыми используются приписанные к ним протоколы.

Целью данной работы является анализ существующих методик выделения ДНК и выявление наиболее приемлемых из них для выделения хромосомного генетического материала из хемолитотрофных ацидофильных микроорганизмов, принадлежащих к родам Acidithiobacillus, Sulfobacillus и Ferroplasma.

Приведем небольшой обзор методов выделения ДНК, используемых в клинической и лабораторно-диагностической практике, и анализ возможностей их применения.

Метод выделения ДНК одношаговый с использованием «Tri reagent». Проба смешивается с 500 мкл 0,9 % раствора хлорида натрия и центрифугируется при 5000 об/мин в течение 10 мин дважды с заменой супернатанта 0,9 % раствором NaCl. Затем осадок обрабатывают лизирующим раствором – раствор «Tri reagent» фирмы Sigma (США) с добавлением детергентов (рН 8,0) и инкубируют при +95 °С в термостате или кипящей водяной бане в течение 10 мин. Далее центрифугируют для осаждения нелизируемых клеточных структур и капель жидкостей на стенках пробирки. Данный метод рекомендуется для выделения ДНК из клеток, культур клеток и монослойной ткани из цельной крови, плазмы или сыворотки.

Метод экстракции ДНК с использованием набора «DIAtomTM DNA Prep». Данный метод является одним из наиболее эффективных для выделения ДНК с минимальной продолжительностью экстрагирования (25 мин для 4–8 жидких проб), не уступающий, а в ряде случаев и превосходящий зарубежные аналоги и по своим характеристикам предназначенный для выделения ДНК из различных биологических материалов (жидкостей, мелкоизмельченных твердых материалов, пятен крови и т.д.), а также для быстрой очистки ДНК из клинических проб (цельной крови, плазмы, сыворотки, мочи, соскобов слизистой и т.д.).

Принцип действия набора «DIAtom™ DNA Prep» основан на использовании лизирующего агента с гуанидинтиоцианатом, который предназначен для разрушения клеток, а также денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии лизирующего реагента ДНК активно сорбируется на NucleoS™ сорбенте, затем легко отмывается от солей и белков спиртовым раствором. ДНК, элюированная из сорбента Экстра-Геном™ или чистой водой, может исследоваться различными методами, в том числе с участием разновидностей полимеразной цепной реакции.

Метод выделения ДНК с применением набора «ExtraGene™ DNA Prep». Метод предназначен для быстрого (не более одного часа) выделения ДНК из цельной крови, пятен крови или других биологический жидкостей, из клеточных суспензий. Метод не требует использования фенола с хлороформом и осаждения ДНК этиловым спиртом. Для выделения используется ExtraGene™ смола и протеиназа К. Принцип действия отечественного набора ExtraGene™ DNA основан на использовании смолы (смеси ионообменников) для обессоливания среды сорбции низкомолекулярных пептидов и хелатирования (маскировки) двухзарядных катионов металлов (Mg2+, Mn2+, Са2+ и т.д.) и применении протеиназы К для инактивации нуклеаз и других ингибиторов белковой природы. При этом ДНК остается в супернатанте растворенной и свободной, готовой к использованию непосредственно в амплификационных реакциях без дальнейшей очистки [4].

Метод сорбции на силикагеле предполагает лизис микроорганизмов в концентрированном растворе гуанидинтиоцианата, кроме этого обеспечивается сорбция ДНК или РНК на частицах силикагеля в суспензии. Далее после четырех промывок и центрифугирования суммарная нуклеиновая кислота элюируется с высушенного силикагеля водой или слабосолевым буфером.

При перетирании с частицами SiO2 осадок ресуспендировали в 200 мкл раствора содержащего 20 % ДДС (100 мM NaCl, 500 мM Tris (pH 8,0), 20 % ДДС), к раствору добавляли 20 мкл раствора частиц SiO2 (0,005 г/л) производства «SigmaAldrich» (США) в ТЕ-буфере. Перемешивали в течение 5–10 мин. После сорбции ДНК частицы осаждали центрифугированием, супернатант удаляли. ДНК элюировали в 100 мкл воды при температуре 60 °C. Ферментативный способ лизиса заключался в ресуспендировании осадка в 500 мкл буфера (100 мM NaCl, 100 мM Tris, 1 мM цитрата натрия, 5 мM CaCl2, 25 мM ЭДТА, pH 8,0). К раствору добавляли 60 мкл лизоцима (0,1 г/л) «Fermentas» (Литва) и инкубировали при температуре 37 °С в течение 40 мин. Добавляли 10 мкл 20 % ДДС, 60 мкл протеиназы К (20 мг/мл) «Fermentas», инкубировали при 50 °С в течение 30 мин. При обработке CTAB осадок ресуспендировали в 500 мкл лизирующего буфера (0,2 М Tris-HCl, pH 8,0, 0,05 М ЭДТА, 2 М NaCl, 2 %-ный СТАВ), инкубировали в течение 30 мин при температуре 65 °С. При обработке KOH осадок ресуспендировали в 500 мкл лизирующего буфера (10 % ПЭГ – 200, 20 мМ KOH), инкубировали 10 мин при температуре 98 °С.

После этапа лизиса проводили очистку от ингибиторов с помощью стандартной методики фенол-хлороформной экстракции [8]. После преципитации ДНК растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера.

Рассмотренные нами методики выделения и очистки хромосомной бактериальной ДНК являются относительно универсальными, а значит, могут быть использованы при работе с хемолитотрофными микроорганизмами. При экспериментальном подтверждении выбранные нами методы продемонстрировали значительные отличия в эффективности выделения нуклеиновых кислот из предоставленных накопительных культур. Это может объясняться и различной эффективностью очистки от ингибиторов, и комплексным составом исследованных образцов [9].

Наилучший результат получен для методики, основанной на лизирующей активности GuSCN. Сходный по эффективности результат был получен для ферментативной методики, однако в данном случае на результат оказали влияние остатки бактериальных нуклеиновых кислот, содержащиеся в реагентах, использованных при выделении ДНК. Использование ферментов при выделении ДНК приводит к значительному сдвигу кривой контроля выделения.

Показана низкая эффективность методик, основанных на лизирующей активности бромида цетилтриметиламмония (CTAB) и на физическом воздействии на клетки с помощью частиц SiO2. Для методики, основанной на лизирующей активности KOH, в присутствии PEG-200, получен средний результат, однако ее принципиальным недостатком является низкая степень очистки препарата ДНК от ингибиторов, в частности ионов железа, содержащихся в некоторых культуральных средах. В то же время этот метод показал лучший результат для проб, содержащих микроорганизмы, не окисляющие железо.

Полученные результаты позволяют рекомендовать для проведения молекулярного анализа структуры сообществ ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов методику, основанную на лизирующей активности GuSCN с последующей очисткой фенолом и хлороформом, поскольку данная методика является апробированной на культурах хемолитотрофных микроорганизмов, достаточно освещена в литературе и может осуществляться при помощи стандартных наборов для выделения ДНК. Данная методика может быть использована для самых различных разновидностей ПЦР, в том числе и для количественной real-time ПЦР [10]. Она может быть реализована при использовании набора «Проба-НК» производства НПО «ДНК-Технология». Однако из-за большого количества стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется высокая степень аккуратности, т.к. возможна перекрёстная контаминация между пробами образующейся аэрозолью ДНК [11].

К числу рекомендуемых следует отнести также метод выделения ДНК путем ферментативного лизиса. При эффективном апробировании данного метода на практике его можно отнести к числу пригодных и рекомендуемых для выделения хромосомной бактериальной ДНК хемолитотрофных микроорганизмов, принадлежащих к родам Acidithiobacillus, Sulfobacillus и Ferroplasma.

Статья написана по материалам сайтов: stud.wiki, www.freepatent.ru, natural-sciences.ru.

»

Помогла статья? Оцените её
1 Star2 Stars3 Stars4 Stars5 Stars
Загрузка...
Добавить комментарий

Adblock detector
Классы МПК: C12N15/10 способы выделения, получения или очистки ДНК или РНК
B82B1/00 Наноструктуры
Автор(ы): Аникеев Олег Евгеньевич (RU) , Кравцова Ольга Александровна (RU) , Бондарь Оксана Викторовна (RU)
Патентообладатель(и): Аникеев Олег Евгеньевич (RU),
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет» (RU)
Приоритеты: